By Stefan Haberstock博士

借助熒光檢測技術您可以進行一些極端敏感，高穩健性且具有廣泛動態范圍的檢測實驗，而試驗的成功取決于下文所述的幾點：激發波長（Ex）和發射波長（Em）的謹慎選擇，靈活敏感的光學器件的選用。

優化熒光檢測—熒光信號的最大化，背景干擾的最小化和任何一種檢測方法一樣，熒光測量法成功的關鍵就在于通過提高信號噪聲比（S/N）來實現靈敏度的提高。在特定的測量過程中，S/N比極大地取決于染料激發（Ex）和發射（Em）波長的特點以及使用時設置的波長和帶寬。

每一個熒光基團都有Ex光譜, 而正是Ex光譜能決定哪些照明波長可以用來最大限度地激發該基團。反過來講, 熒光基團的Em光譜能決定熒光最強時的波長。兩個（Ex和Em）最優波長之間的差異叫做斯托克斯位移。

斯托克斯位移是熒光檢測高靈敏度的基礎

使用適當波長的濾光片或可以自主選擇波長的光柵，我們可以將Ex和Em設置為與最適宜染料相同或相似的波長。選擇最優波長的精準度取決于帶寬。例如，帶寬為20nm的光柵，設置其波長為450nm，那么它會讓波長在 440-460nm之間的光束通過。

帶寬決定了波長選擇的精確度。帶寬20nm意味著在高斯曲線高度的一半處波長為+10nm，而在曲線底部波長將會是+20nm。

當染料的斯托克斯位移小于帶寬之和（Ex + Em）時，對最優Ex和Em的選擇很可能導致間隔或重疊。也就是說，用于Ex的光束將會通過Em濾光片或光柵到達光電倍增管（PMT），導致錯誤的假陽性結果。
 

Ex和Em帶寬的重疊導致假陽性結果

因為狹窄的帶寬總能使最優Ex和Em被選入，所以窄帶寬看上去是更為可取的。但狹窄的帶寬也降低了能量輸入、檢測限度和S/N比。大多數情況下，當Ex和Em的帶寬在15–20nm左右，且波長設置不以優化Ex和Em為目的的時候，儀器能提供最佳的檢測限度和S/N比。

以Ex和Em帶寬間的最佳距離（Ex + Em + 5nm）設置波長，來防止重疊并產生最佳的檢測限度和S/N比。

熒光基團會受所處環境影響

染料的Ex和Em特性能被與其結合的分子以及所處環境的理化性質所影響。環境因素包括溫度，離子強度和pH值。因此，優化檢測方案應包括應用光柵掃描Ex和Em，以確定在某特定條件下染料的最佳Ex和Em值。

一般來說，光柵的靈敏度要低于濾光片，這進一步導致了我們在開發檢測方案的過程中對靈敏度的要求的降低。通常情況下，在一次測量過程中我們僅掃描Ex和Em的帶寬。因此，當我們使用濾光片記錄染料最大激發波長或發射波長時，理想化的光學系統將會是濾光片和光柵的組合。

強大的多重分析技術，需要強大的光電倍增管支持

多重樣本分析的熒光檢測技術能夠在多種情況下使熒光檢測技術成為一種選擇。但如上文所述，光譜的重疊能通過引入干擾而降低檢測的靈敏度。尤其是在一次檢測中使用多種染料（多重分析） 的情況下，這一點變得更為重要，并且我們需要特別注意對染料的選擇。由于熒光技術的廣泛普及，許多染料和許多版本的熒光蛋白現已可以讓我們在全光譜范圍中使用。

在本文中，光電倍增管 (PMT) 的光譜性能顯得尤為重要。許多PMT已為熒光技術進行了優化，能在發出波長在500nm上下的綠光。但是，那些能夠發射波長超過600nm紅光的染料對優化后的PMT仍是一個難題。這就可能會導致檢測敏感性的顯著降低，而作為補償，我們需要使用更高濃度的反應物，進而增加了實驗費用且降低了檢測技術的魯棒性。如果您想進行多重樣本分析的話，您需要對PMT的光譜響應多加留意。